Com identificar un bacteri

Content

• etapes
• Mètode 1 Identificar un bacteri mitjançant una taca de Gram
• Mètode 2 Realitzeu la prova de tinció de Ziehl-Neelsen
• Mètode 3 Estudi del comportament i aspecte dels bacteris
• Mètode 4 Interpreta tots els resultats

En aquest article: Identificar un bacteri mitjançant la tinció de gram Realitzar el test de tinció de Ziehl-NeelsenEstudiar el comportament i l'aparença dels bacterisInterprendre tots els resultats43 Referències

La identificació dels bacteris és una tasca complexa. Una de les raons és que, segons les estimacions, hi ha entre 10 000 i 1 mil milions d’espècies bacterianes al món! Identificar correctament els bacteris és molt important, sobretot en l’àmbit mèdic, on el tractament adequat d’una malaltia depèn en gran mesura del tipus de microbi que causa el problema. En la majoria dels casos, la identificació es fa a partir de l’eliminació. Per identificar un bacteri, heu de realitzar proves de tinció, analitzar el seu aspecte i observar com respon bé a diferents condicions. Si necessiteu un resultat ràpid, feu una mostra d’ADN per enviar-la a un laboratori.

etapes

Mètode 1 Identificar un bacteri mitjançant una taca de Gram

1. determinar si el bacteri és gram positiu o negatiu. La tinció de gram és un mètode per dividir els bacteris entre els dos tipus més comuns: Gram positiu i Gram negatiu. Els primers tenen una gruixuda paret cel·lular formada per un polímer anomenat peptidoglicà, que té la millor tinció com a parets primes dels bacteris Gram-negatius.
   • Alguns tipus comuns de bacteris Gram-positius són estreptococs, estafilococs, micrococis (o micrococis) i listeria.
   • A continuació, es mostren alguns exemples habituals de bacteris gramnegatius: Neisseria, Acinetobacter, Moraxella, Enterobacteriaceae, Vibrio, Haemophilus, Fusobacterium i Campylobacter.
2. Preneu les mesures de protecció adequades. Els bacteris i elements químics que utilitzeu durant la prova suposen un risc per a la vostra salut. Porteu ulleres de seguretat, guants d’un nitril d’un sol ús i un abric de laboratori en realitzar la prova de tinció. Un cop acabat, poseu els guants i la resta de materials contaminats en una bossa especial. Recordeu-vos de seguir els procediments del vostre laboratori per desfer-vos de la bossa de productes contaminats.
3. Poseu la mostra a observar sobre un portaobjectes de vidre. Per començar la prova, poseu una gota o espècie bacteriana sobre un portaobjectes estèril. A continuació, feu lliscar la fulla sobre un cremador Bunsen encès tres vegades per fixar la mostra i evitar que surti de la placa quan esbandiu o afegiu els reactius.
4. Afegiu 5 gotes de cristall morat a la fulla. Aboqueu cinc gotes d’una solució violeta de cristall a la mostra. Espereu un minut perquè la mostra absorbeixi el cristall violeta.
   • Mantingueu la fulla al seu lloc amb passadors de roba per no tacar-vos les mans.
5. Rentar bé la fulla per treure la taca. Utilitzeu una aixeta o una ampolla de compressió i deixeu que l’aigua funcioni molt lentament fins a cinc segons per eliminar residus de tinta que no s’han adherit a la mostra.
6. Aboqueu-ne cinc gotes d'una taca de díode Gram sobre la diapositiva. És una solució formada per díode, bicarbonat de sodi i diòdur de potassi que fa que el violeta de cristall es fongui amb les parets cel·lulars del bacteri. Aboqueu cinc gotes de la solució sobre la mostra i deixeu-ho un minut més.
7. Renteu la mostra amb alcohol o àcid làctic. L’alcohol i la lacetona són agents blanquejadors i eliminaran la tinció de parets cel·lulars bacterianes si són gramnegatives. Aboqueu-hi unes gotes de lleixiu sobre la mostra i deixeu-ho funcionar no més de tres segons. Després d'això, intenteu esbandir suaument amb aigua durant cinc segons per eliminar aquests agents blanquejadors.
   • Si permeteu que el blanqueig funcioni durant molt de temps, es pot produir la desaparició de la tinció de bacteris Gram positius, provocant un fals negatiu.
8. Feu una prova de contrast amb safranina. La safranina és un colorant vermell que contrasta amb el cristall violeta, colorant així els bacteris sense afectar-los per la tinció morada. Aboqueu unes cinc gotes de safranina sobre la mostra i deixeu-ho un minut. Després d'això, intenteu esbandir suaument amb aigua durant cinc segons.
9. Visualitzeu la mostra amb una ampliació de 1000X. El bacteri es tornarà morat o porpra si és gram positiu o de color rosa si és gram negatiu per culpa de la safranina.

Mètode 2 Realitzeu la prova de tinció de Ziehl-Neelsen

1. Utilitzeu aquesta tècnica per detectar bacteris ràpids amb àcids. Aquestes espècies contenen una major quantitat de lípids, fent-los més resistents als colorants utilitzats en la tinció de Gram. Els bacteris resistents als àcids pertanyen al gènere Mycobacterium, que inclou el bacteri responsable de la tuberculosi (M. tuberculosis). Per tenyir un bacteri resistent a l’àcid, heu d’utilitzar un colorant vermell anomenat fuchsina carbòlica, resistent a esbandir amb solucions àcides o sulfúriques.
2. Preneu les mesures de protecció adequades. Els materials químics i biològics utilitzats durant la tinció de Ziehl-Neelsen poden ser perillosos. A més, també haureu d’utilitzar fonts de calor, com ara un tub Bunsen, un escalfador elèctric o una làmpada d’alcohol. Seguiu les instruccions següents per realitzar la prova.
   • Poseu ulleres, guants de nitril i un abric de laboratori.
   • Tingueu cura de no inhalar vapors de colorants i blanquejadors i no deixeu que les gotetes esquitxin els ulls ni la pell. Manteniu els contenidors oberts sota la caputxa.
   • Tingueu molta cura en escalfar la fulla. La majoria dels productes químics utilitzats són inflamables. També hi pot haver rastres de substàncies inflamables a les corredisses o altres equips.
3. Prepareu la fulla. Amb moviments circulars, repartiu uniformement una petita quantitat de la mostra bacteriana al centre d’un tobogan estèril. La vostra mostra hauria d’ocupar uns 10 mm per 20 mm.
4. Assecar la fulla. Col·loqueu la fulla sobre l'estructura d'assecatge amb la mostra cap amunt. Deixeu-lo assecar de manera natural durant 30 segons. No intenteu assecar la fulla amb un drap.
5. Assegureu la mostra amb calor. Amb la mostra cap amunt, llisqueu la fulla dues o tres vegades sobre un cremador Bunsen encès. També podeu col·locar la fulla en un escalfador elèctric ajustant la temperatura entre 65 ° C i 75 ° C durant almenys dues hores. Teniu cura de no bullir ni cremar la mostra.
6. Afegiu la fuchsina carbòlica a la fulla. Aboqueu diverses gotes d’aquesta solució sobre la diapositiva. Aboqueu prou com per cobrir la mostra completament.
7. Escalfeu la fulla per fixar el colorant. Escalfeu el portaobjectes amb cura sobre un cremador Bunsen o una làmpada d'alcohol, amb la mostra dirigida cap amunt o poseu-la sobre un escalfador elèctric. Escalfeu la fulla a 60 ° C o fins que comenci a alliberar vapor. Deixeu actuar el colorant durant cinc minuts.
   • Si utilitzeu un escalfador elèctric, enceneu-lo a 60 ° C. Si opteu per la làmpada alcohòlica o el cremador Bunsen, haureu d’esperar veure fums.
   • Per mantenir la fulla a la temperatura desitjada durant cinc minuts, escalfeu-la de manera intermitent.
   • Teniu cura de no bullir, cremar ni assecar la mostra.
8. Esbandiu la fulla amb aigua freda. Deixeu-ho refredar durant cinc minuts i esbandiu suaument uns segons amb aigua clara. Utilitzeu l’aigua de l’aixeta o una ampolla de compressió per eliminar les taques de tint que no s’han adherit a la mostra.
9. Aboqueu sobre la mostra alcohol àcid o àcid sulfúric. Utilitzeu un volum del 3% en volum (v / v) d’alcohol o 20% d’àcid sulfúric per cobrir completament la mostra. Deixeu que l’àcid funcioni fins que el color s’esvaeixi i arribi a una ombra de color rosa molt brillant. El procés sol durar uns deu minuts.
10. Utilitzeu aigua neta per esbandir la fulla. Renteu suaument la fulla sota un aixeta o amb una ampolla de compressió. Retireu bé tots els residus d’àcids i colorants.
11. Afegiu l’agent de contrast. Un cop heureu esbandit el portaobjectes, aboqueu el colorant de verd malacita o blau de metilè. Aquestes dues solucions creen un fons blavós o verdós sobre el qual sortirà el colorant vermell, i també altres materials biològics, com les cèl·lules humanes i els bacteris no resistents a l’àcid. Deixeu que les substàncies funcionin d’un a dos minuts.
12. Esbandiu i assequeu la fulla. Esbandiu bé amb aigua per eliminar l'excés de contrast. Un cop acabat, assequeu la part posterior de la fulla amb un drap sec i deixeu que s’assequi de manera natural sobre un suport.
13. Visualitzeu la mostra amb una ampliació de 1000X. Els bacteris resistents a l’àcid es tornaran vermells o de color rosa fosc. Altres bacteris, cèl·lules no bacterianes i la base de la fulla es tornaran verdes o blaves.

Mètode 3 Estudi del comportament i aspecte dels bacteris

1. Analitzar la forma del bacteri. Després de realitzar la prova de tinció per determinar si els bacteris són grampositius, gramnegatius o resistents a l’àcid, és hora d’identificar l’espècie amb més precisió. Primer, analitzeu la forma dels bacteris que hi ha a la diapositiva. Les tres formes més habituals són els coccius (esfèrics), els espirals i els bacils (forma de vareta).
   • Hi ha diverses variants d’aquestes formes. Els bacteris de forma rodona (coccus), per exemple, poden aparèixer per parelles (diplococis), en cadenes, en munts o en grups de quatre (tetrads).
2. Esbrineu si el bacteri és aeròbic o anaeròbic. Preneu dues mostres de bacteris i creeu dos cultius separats. La lluna ha de ser anaeròbica (cultivada sense oxigen), mentre que l’altra ha de ser aeròbica (conreada amb oxigen). Guardeu el cultiu anaeròbic a 35 ° C en un lloc lliure d’oxigen durant almenys 48 hores abans d’observar el creixement.
   • Si els bacteris creixen en un entorn sense oxigen, però no quan s’exposen a l’oxigen, vol dir que són anaeròbics.
   • Tot i que es desenvolupen en un entorn oxigenat, però no en absència d’oxigen, són aeròbics.
   • Quan es desenvolupen en ambdós ambients, parlem de bacteris anaerobis facultatius.
3. Feu una prova de motilitat. Un bacteri és mòbil si es pot moure sol amb un o més flagels. El grau de motilitat és molt important en la identificació de certes espècies bacterianes. Hi ha diversos tipus de motricitat, però la forma més segura i llegible és el medi semisòlid.
4. Crea una cultura per a la prova de motilitat. Prepareu un cultiu de bacteris en un brou de cultiu. Seguiu les instruccions a continuació per preparar el brou que escolliu.
5. Inocular el cultiu en un agar semi-sòlid per a proves de motilitat. Recobrim una part del cultiu de brou amb una agulla d’inoculació estèril. Planteu amb cura l’agulla al tub dagar semisòlid, com el lagar TTC, que heu preparat per fer la prova. L’agulla ha de penetrar a 2/3 de l’agar.
   • En acabar, traieu l’agulla amb cura, tenint cura de no sobrepassar els límits de la zona d’inoculació.
   • Incubar el tub a 30 ° C durant 48 hores.
6. Llegiu el resultat de la prova. L’agar per a la prova de motilitat es tornarà vermell al contacte amb els bacteris. Si són mòbils, aquesta tinta vermella o rosada s’estendrà per tota la substància. En cas contrari, la tinció es limitarà al lloc de la injecció.

Mètode 4 Interpreta tots els resultats

1. Reuneix els teus comentaris. Per conèixer el tipus de bacteris, haureu de reunir la informació obtinguda de les cultures, les proves de coloració i l’observació de les formes. Si examinesu les mostres d’un pacient, els símptomes que presenten també poden ajudar a determinar el tipus de bacteris adequat.
   • Per exemple, si les proves demostren que el bacteri és gramnegatiu, anaeròbic, no mòbil i es detecten símptomes com ara dolor abdominal, nàusees i vòmits en el pacient, és probable que el pacient pateixi una infecció de bacterians. fragilis.
2. Consulteu una base de dades. Hi ha milers d’espècies de bacteris al món. És impossible saber-ho tot de cor. Probablement haureu de consultar un llibre de microbiologia clínica o una base de dades en línia per comparar els resultats de les proves amb la informació sobre espècies bacterianes.
   • Hi ha recursos en línia excel·lents per identificar bacteris, però la majoria d’aquestes bases de dades estan disponibles en anglès, inclosos Patricbrc.org i GlobalRPh. Tot i això, encara podeu trobar informació útil al lloc web del Centre de Recursos Microbials Internacionals d'INRA.
3. Feu una prova genètica per conèixer les espècies exactes del bacteri. En alguns casos, és possible que necessiteu identificar les espècies de bacteris. El mètode més ràpid i fàcil és realitzar una prova d’ADN. Les proves d'ADN són també útils per identificar bacteris resistents a les formes tradicionals de cultiu i cultiu. Avui en dia, les proves d’ADN sobre microorganismes són molt ràpides i poden estar a punt en menys de dues hores.
   • Si no teniu accés a un laboratori que realitzi seqüenciació genètica de microorganismes, envieu una mostra bacteriana a una agència especialitzada.